1) 总RNA提取
2) 已知序列的验证:根据客户提供的已知序列设计引物,以总RNA为模板进行RT-PCR扩增,验证参考序列的存在及方向。
3) 5’和3’RACE
a) RNA的去磷酸化处理
b) RNA的3’末端处理;RNA的5’末端处理
c) cDNA的合成
d) 5’和3’RACE的PCR反应
e) PCR产物构建TA克隆
f) 分别随机挑取10个克隆进行测序
4) 对获取的序列进行验证以验证获取的5' RACE或3' RACE序列与已知序列是否连续存在于同一条cDNA片段上。
客户提供
总RNA量大于10 mg,如果基因的丰度较低或者未知序列较长,请提供尽量多的实验材料。
已知的参考序列长度≥200 bp。
我们提供
构建好5’和3’RACE的TA克隆(含20%甘油的LB培养基),装到PMD18-T载体上;测序图谱;实验报告
质量保证
获取的5' RACE或3' RACE序列与已知序列连续存在于同一条cDNA片段上